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教你如何选择最合适的载体----@古朵新闻

提供者:上海古朵生物科技有限公司   发布时间:2020/3/17  阅读次数:60次   进入该公司展台

研究基因功能的生物医学小白在课题最开始往往都是从构建一些必要的载体入手。那面对眼花缭乱的载体list(无论是Addgene还是公司)小白们更是无从下手。读完本文,小白们会在一夜之间成为载体构建的“老司机”。
 
   大体上来说,我们研究功能无非就是在体外(in vitro)和体内(in vivo)两种实验体系中对我们的目的基因功能加以描述,如图1所示。

 
图1 基因功能研究的两种类型。
  对于体外研究中的细胞系(或者原代细胞),我们更多会选择转染、慢病毒、逆转录病毒或者腺病毒;而对于体内研究,我们主要选择购买遗传修饰的动物模型,或者直接选用AAV介导的遗传干预。
  基因功能研究无非就是三种手段-①过表达、②敲低(减)表达、③敲除,剩余的就是检测这三种干预手段对功能表型的定量和定性影响。下面我们分述在哺乳动物细胞实施这三种干预手段分别对应的载体选择。
 
  一、过表达
过表达的意思就是人为过量表达你的目的基因。这一类型的载体选择主要关注一下两点:
1、启动子
对于哺乳动物细胞来说,常见载体的泛表达启动子常见的基本就这几个-CMV, SV40, EF1a, CAG。大部分都选择CMV、CAG或者EF1a其中之一即可,SV40表达能力稍弱。但对于免疫细胞、干细胞我们推荐选择EF1a即可
比如图2所示的载体是哺乳动物最常用的过表达载体。需要说明的是,对于其他模式生物的细胞,比如细菌、酵母、果蝇、线虫、昆虫、爪蟾等并不适用。
 
 
图2 pCDNA3.1是哺乳动物中过表达最常用的商业化载体类型。其目的基因得分启动子是CMV。
 
2、标签
如果过表达是编码蛋白的基因,通常我们会建议加个标签(Epitope tag)。其目的是给过表达的目的基因做个特殊标记,从而有利于后续的检测(你的过表达确定表达了么?表达量如何?)。
所以这种标签通常体积较小,不会影响目的蛋白的构象、定位、功能等。比较常用的标签有FLAG、HA、Myc、GFP等,我们一个基因通常只需选一种即可,不过有时候这些标签需要多串联几个(比如,3´FLAG,3´HA,6´Myc等)一起增强检测的灵敏度。我们不讲标签的区别,他们本质上都是一段可以编码蛋白的基因片段。
载体构建的时候我们的目的基因跟这些标签都是融合表达在一起的(通常标签位于目的基因的下游,也叫做(基因的)3‘端,(蛋白的)C端)(图3),后续我们只需要购买能特异性识别对应标签的抗体做免疫印迹或者免疫荧光检测即可。
 
 
图3 实例:过表达基因下游带有融合3´FLAG的载体
3、选择标记
选择标记(Selectable Markers)主要目的是区分表达于非表达目的基因的细胞。
常见的选择标记有Puromycin、Blasticidin、Neomycin、Hygromycin、Zeocin和各种荧光蛋白如ZsGreen、EGFP、RFP、mCherry等。
Puromycin、Neomycin、Hygromycin、Zeocin是一类可以用对应的小分子药物筛选的标记;荧光蛋白标记可以借助荧光显微镜直观的观察到表达目的基因的细胞,也可以直观的估计感染效率等。
所以,原则是如果允许,Puromycin、Neomycin、Hygromycin、Zeocin中的一种其中一个,比如puromycin(最常用),和荧光蛋白标记中的任选一个,比如ZsGreen(最常用)等。实例如图4所示。

 
图4 实例。此过表达载体带有绿色荧光蛋白ZsGreen和Puromycin双重标记。
 
二、敲低(减、降)表达
这类载体的选择要简单很多,启动子选择U6即可。但标记选择通常跟过表达类似,尽量选Puromycin和ZsGreen,如图5所示。

 
图5 带有ZsGreen和Blasticidin(BSD)双重标记的敲减型载体。
三、敲除载体
目前最常用的就是CRISPR-Cas9的基因敲除载体,该系统是个二元结构,需要在同一个细胞中一起表达Cas9和针对目的基因的sgRNA。目前所用的载体有二合一的,也有分开两个载体的。我们优先推荐二合一型载体。
此类型的载体也是U6启动子驱动的载体,由于Cas9体积过大,通常这类二合一载体仅会带有一个标记,如Puromycin或GFP,但也有人用同时带有两个标记的载体。如图6所示。

 
图6 基于CRISPR-Cas9的基因敲除载体。我们发现该载体带有ZsGreen标记。同时Cas9C端融合FLAG标签。
 
注意:

  1. 对于腺病毒载体,由于其感染效率极高,通常只需要带荧光蛋白单个标记即可,但推荐编码蛋白的目的基因过表达时带常见标签融合表达;
  2. 对于在体基因功能研究,我们常用AAV载体,这类载体我们往往只需要待单个荧光蛋白标记即可,但推荐编码蛋白的目的基因过表达时带常见标签融合表达。

 
总结
繁杂的载体类型,我们只需要按照①过表达、②敲低(减)表达、③敲除分类,按照上述原则简单选择目的载体即可。即使我们看不太懂质粒图谱也可以做出快速正确的选择。

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